支原体（Mycoplasma）别名霉形体，直径只有100-200nm，正好可以穿过0.22um滤膜，逃过光学显微镜分辨率的极限，我们看不到它，也过滤不了它，可谓狡猾至极。若放任支原体肆意繁殖，它会通过气溶胶传播，甚至污染整个细胞房里所有的细胞，严重影响实验研究。毫不夸张地说，支原体污染是细胞培养中最令人头疼的麻烦之一。因此，及时发现并清除支原体污染对于维护细胞地健康状态至关重要。

本文中，小尚将介绍几种非常方便的支原体检测方法，帮助科研人员更好地应对这一问题。

常规PCR法

支原体16S rRNA、16S-23S rRNA、23S rRNA是进化上较为保守的大分子, 据此设计特异性引物。取培养细胞3-5天的上清作为模板，使用PCR的方法扩增后, 进行琼脂糖凝胶电泳，用成像仪观察是否有支原体基因扩增条带。目前已有许多文献公开不同种类支原体引物序列。

优点：灵敏度高、特异性高、检测周期较短

缺点：对仪器要求高（需要准备PCR仪，电泳仪、成像仪等设备）、操作较复杂

▲ 常规PCR检测结果[1]

巢式PCR法

设计两对引物（外围引物与内围引物），取培养细胞3-5天的上清作为模板，进行两次PCR扩增反应。第一次PCR用外围引物的将支原体保守区DNA进行大量扩增，以内围引物对第一次PCR产物其进行第二次扩增。此方法极大地提高了灵敏度和特异性，可检测微量污染。

PCR产物测序后可确定支原体类型。

优点：灵敏度很高、特异性很高、检测周期较短

缺点：对仪器要求高（需要准备PCR仪，电泳仪、成像仪等设备）、操作较复杂

▲ 巢式PCR检测结果[2]

环介导等温扩增法（LAMP法/显色法/一步法）

DNA在65℃条件下处于一个动态平衡的状态，而Bst DNA聚合酶可在等温条件下扩增DNA模板。因此使用数对引物及Bst DNA聚合酶，在65℃条件下进行等温环介导扩增，可将微量的支原体DNA扩增上亿倍。与PCR相比，不需要模板热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，用一个简单地恒温装置就可以完成检测，而且特异性和灵敏度并不逊色于PCR法。

优点：在恒温条件下实验，直接观察颜色判断，对操作和设备要求低

缺点：当污染为弱阳性的时候，颜色的变化可能不明显，容易造成错误的结果解读

▲ LAMP法检测结果

化学发光法（酶法）

通过裂解支原体，释放特有酶催化合成ATP，产生的ATP与试剂中的荧光素酶发生反应，通过比较反应前后荧光量变化确定样品中是否含有支原体污染。该方法可以有效、快速、灵敏的检测支原体污染，只需要少量样品即可检测支原体污染情况。

优点：快速、简便

缺点：对仪器要求高，化学发光仪或可以检测化学发光的酶标仪、化学发光专用96孔板

▲ 酶法检测结果[3]

DNA荧光染色法

使用DNA荧光染料（如Hoechst33258、DAPI等）对细胞进行染色，无污染细胞只有细胞核着色，而受污染细胞细胞质及细胞周围会出现大小、形态不规则的荧光着色。

优点：操作简便，成本低，快速，直观

缺点：灵敏度低，难以判断轻度污染，可作为初步筛查手段，需结合其他方法检测

▲ DAPI染色检测结果[1]

支原体检测方法有很多种，除了上述几种方法，还有培养法、电镜观察法、ELISA法等，每种方法各有利弊，科研人员应根据实验需求和实际情况选择合适的检测方法。使用两种或两种以上的方法进行检测，结果可信度更高。同时，定期对细胞进行支原体检测也很重要哦！

参考文献：

[1]桂馨,钱洁,许洁,等.细胞培养过程中支原体污染的检测及预防[J].同济大学学报(医学版),2013,34(03):24-27.

[2]黄海军,高其双,彭霞,等.细胞支原体巢式PCR检测方法的建立及应用[J].湖北农业科学,2014,53(03):690-693.DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.03.049.

[3]卢勇,贾继宗,唐静,等.3种支原体检测方法的比较[J].中国生物制品学杂志,2015,28(10):1067-1071.DOI:10.13200/j.cnki.cjb.001091