任务驱使，直接看代码不明白是在干嘛。所以找了基因课的WGCNA课程来看，链接：http://genek.tv/，本文是该课程的学习记录。

文章下载链接：

Transcriptome analysis of an apple (Malus × domestica) yellow fruit somatic mutation identifies a gene network module highly associated with anthocyanin and epigenetic regulation
https://www.researchgate.net/publication/282287679_Transcriptome_analysis_of_an_apple_Malus_domestica_yellow_fruit_somatic_mutation_identifies_a_gene_network_module_highly_associated_with_anthocyanin_and_epigenetic_regulation

概念补充

基因共表达网络

寻找协同表达的基因模块（module),探索基因网络与研究的性状之间的联系。

加权基因共表达网络

Weighted Gene Co-expression Network Analysis 即WGCNA--构建基因表达网络的典型系统生物学算法，适用于芯片、RNA-seq，需要至少15个样本。

实验设计

实验材料是两个品种的苹果，一种是红苹果KID，另一种是黄苹果BLO，4个生长阶段（S1-S4）各取样一组（3个重复），每种取4组样本，分别对这8组24个样品进行转录组测序和花青素含量测定。

差异分析

ABCD分别以韦恩图展示了：不同时期两类苹果的差异基因（A）；同一类苹果不同时期的差异基因（B、C）；两类苹果各个时期共有的差异基因和两类苹果S1与S4的差异基因（D）；

WGCNA分析

step1模块划分

按基因表达模式进行基因聚类，自动将表达模式相似的基因划分为一个模块，同一模块的基因在功能上可能具有相关性。

step2：模块与花青素含量的相关性分析

对3299个差异基因划分为9个主要模块，其中Pink与花青素的相关系数达到0.95，该模块的34条基因是研究重点。

step3：对相关性最高的模块的所有基因进行可视化展示

step4：从相关性最高的模块中筛选最重要的基因

pink模块种的基因与花青素含量进行相关性分析，计算Gene significance（GS）值。

GS最高的两个基因是MdMYB10和MdGST。对GS较高的几个基因进行qPCR验证。MdGST是花青素存储和运输过程中的重要基因，MdMYB10是一个MYB类型的转录因子。

step5：qPCR验证表达量差异

表达量差异只是现象，对差异背后的原因进行筛选：

原因一：DNA变异

未发现DNA序列变异

原因二：表观修饰

使用McrBC-PCR方法鉴定MDMYB10启动子区域的甲基化水平
1.MdGST未发现甲基化水平差异
2.MdMYB10的MR3和MR7区域存在差异甲基化，甲基化水平黄苹果高于红苹果，表达量黄苹果显著低于红苹果。

原因三：转录调控

MdGST上有19个MYB类型转录因子的结合位点，可能有转录因子调控。

结论

黄苹果中，MdMYB10基因上游的甲基化抑制了该基因的表达，而该基因是一个转录因子，转录因子的低表达导致了MdGST的低表达，MdGST是花青素存储和运输的关键基因，因此导致了花青素含量降低，导致苹果颜色差异。

WGCNA分析步骤

输入数据：表达矩阵
构建共表达网络
将表达模式相近的基因划分为一个模块
模块与性状之间的关联分析，找到与目标性状相关性最高的模块
（模块之间的关联分析）
模块中核心基因的鉴定

WGCNA的核心理念

关心模块与性状之间的关系，而非单个基因与性状的关系